基因診斷的名詞解釋_分類_舉例_的基本原理(2)
基因診斷的基本原理
核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。 基因診斷技術(shù)它的基本原理是：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠進(jìn)行雜交。這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補(bǔ)的原則進(jìn)行，它不僅能在DNA和DNA之間進(jìn)行，也能在DNA和RNA之間進(jìn)行。因此，當(dāng)用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。由此可見，進(jìn)行基因檢測有兩個必要條件，一是必需的特異的DNA探針;二是必需的基因組DNA。當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進(jìn)行分子雜交。
一、基因探針基因探針(probe)就是一段與目的基因或DNA互補(bǔ)的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。
1.探針的來源 DNA探針根據(jù)其來源有3種：一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNa 探針(cDNa probe)。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。2.探針的制備 進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克隆(molecular cloning)獲得的?？寺∈侵赣脽o性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體(噬菌體、質(zhì)粒等)中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。
為了制備cDNA 探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過程中切除。
寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。
3.探針的標(biāo)記 為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nicktranslation)。
探針的標(biāo)記也可以采用隨機(jī)引物法，即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機(jī)DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后，按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。
二、限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)，又簡稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。
限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發(fā)現(xiàn)的限制酶多達(dá)數(shù)百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據(jù)其來源命名。
每種限制酶識別和切割的通常為4-6個核苷酸序列，稱為限制性位點(diǎn)(restriction sites)或切點(diǎn)。限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端(cohesive terminus);第二種為平整切割。
限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：①首先不論DNA的來源如何，用同一種內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細(xì)菌或人和質(zhì)粒任何兩個DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術(shù)的基礎(chǔ)。②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機(jī)的，因而從每個細(xì)胞的基因組得到的是相同的一組長度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。③由于限制酶的特異性，如果識別位點(diǎn)的堿基發(fā)生了改變，限制酶將不再能切割;同樣，堿基的改變也可能導(dǎo)致出現(xiàn)新的酸切位點(diǎn)。在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點(diǎn)的消失或出現(xiàn)將影響獲得的DNA片段的長度，表現(xiàn)為限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。
三、限制性片段長度多態(tài)性一個人的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100-500個堿基對就有一個是不相同的。換言之，如果把兩套基因組DNA(各3.2×109bp)排列起來，那么平均有1000萬處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。實(shí)際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。
DNA的多態(tài)性雖可通過DNA測序檢出，但用限制酶消化卻是最常用的檢測方法。
1.RFLP由于堿基的變異可能導(dǎo)致酶切點(diǎn)的消失或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，從而引起不同個體在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymporphism, RFLP)。RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。用Southern雜交檢出RFLP時，如探針跨越切點(diǎn)，則被切開的兩個片段均可與探針雜交，從而顯示兩條雜交帶。
2.兩點(diǎn)RFLP
(1)點(diǎn)多態(tài)(point polymorphism)：是由于單個或少數(shù)堿基的改變引起酶切點(diǎn)的出現(xiàn)或消失所致的RFLP。上述的RFLP即屬于這一類。它們屬經(jīng)典的RFLP。在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)數(shù)以百計(jì)的此類多態(tài)位點(diǎn)。
(2)數(shù)目變異的串連重復(fù)(variable number tandem repeats,VNTR)：上述經(jīng)典的單個堿基取代所致的RFLP一般只能檢測到一種雜合性的兩種形式，即“有”或“無”某個限制酶切位點(diǎn)，而且每個位點(diǎn)在人群中的雜合子頻率通常不會超過50%，當(dāng)被測個體為純合狀態(tài)時，利用RFLP就無法得到所需要的多態(tài)信息。此外，在整個基因組中，這類RFLP目前發(fā)現(xiàn)的數(shù)量還有限，并分布不勻。
但是，在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每一個單位通常只有16-28bp長，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時，只要酶切點(diǎn)不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長度不同的片段與小衛(wèi)星DNA不同，另一類重復(fù)序列是衛(wèi)星DNA。它們的基本序列有1-6bp，如(TA)n、(CGG)n等，通常重復(fù)10-60次并呈高度的多態(tài)性。
VNTR具有高度的變異性，同時也是按照孟德爾方式遺傳的，因此是很好的遺傳標(biāo)記，由于它們類型眾多和在基因組中分布廣泛，因而在基因連鎖診斷中應(yīng)用日益廣泛。
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