高二生物選修一復習資料(2)
高二生物選修一復習資料
專題二 微生物的培養(yǎng)與應用
課題一 微生物的實驗室培養(yǎng)
·培養(yǎng)基:人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求,配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì),是進行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。
·培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖,在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑)后,制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長,可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應用于工業(yè)或生活生產(chǎn),固體培養(yǎng)基應用于微生物的分離和鑒定,半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運動及菌種保藏等。
·按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學物質(zhì)配制而成,其中成分的種類比例明確,常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學成分不明的天然物質(zhì)配制而成,常用于實際工業(yè)生產(chǎn)。
·按照培養(yǎng)基的用途,可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì),以抑制不需要的微生物生長,促進所需要的微生物的生長。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點,在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成的,用以鑒別不同類別的微生物。
·培養(yǎng)基的化學成分包括 水 、 無機鹽 、 碳源 、 氮源 (生長因子)等。
·碳源:能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無機碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。
·氮源:能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+(無機氮源)蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有機氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。
·培養(yǎng)基還要滿足微生物生長對PH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如,培養(yǎng)乳酸桿菌時需要在培養(yǎng)基中添加維生素,培養(yǎng)霉菌時須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性,培養(yǎng)細菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性,培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無氧的條件
·無菌技術(shù)·獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵,要注意以下幾個方面:
?、賹嶒灢僮鞯目臻g、操作者的衣著和手,進行清潔和消毒。
?、趯⒂糜谖⑸锱囵B(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進行滅菌。
?、蹫楸苊庵車h(huán)境中微生物的污染,實驗操作應在酒精燈火焰附近進行。
?、軐嶒灢僮鲿r應避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。
無菌技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外,還有什么目的?
答:無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。
·消毒與滅菌的區(qū)別
消毒指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法,巴氏消毒法(對于一些不耐高溫的液體)還有化學藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線消毒。
滅菌則是指使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物,包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。
滅菌方法:
①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法;
?、诓A髅?、金屬用具等使用干熱滅菌法,所用器械是干熱滅菌箱 ;
③培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法,所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。
?、鼙砻鏈缇涂諝鉁缇仁褂米贤饩€滅菌法,所用器械是紫外燈 。
(1)方法步驟:計算、稱量、溶化、滅菌、倒平板?! ≈谱髋H飧嗟鞍纂斯腆w培養(yǎng)基
(2)倒平板操作的步驟:
①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上,右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶,左手拔出棉塞。
?、谟沂帜缅F形瓶,將瓶口迅速通過火焰。
?、塾米笫值哪粗负褪持笇⑴囵B(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙,右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~20mL)倒入培養(yǎng)皿,左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。
④等待平板冷卻凝固,大約需5~10min。然后,將平板倒過來放置,使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。
·倒平板操作的討論
1.培養(yǎng)基滅菌后,需要冷卻到50℃左右時,才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度?
提示:可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶,感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時,就可以進行倒平板了。
2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰?
答:通過灼燒滅菌,防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。
3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置?
答:平板冷凝后,皿蓋上會凝結(jié)水珠,將平板倒置,既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地揮發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染。
4.在倒平板的過程中,如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么?
答:空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生,因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。
純化大腸桿菌
(1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。
(2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng),可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落。
(3)稀釋涂布平板法是將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面,進行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。
(4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是:使聚集在一起的微生物分散成單個細胞,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落,以便于純化菌種。
(5)平板劃線法操作步驟:
?、賹⒔臃N環(huán)放在火焰上灼燒,直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán),并打開棉塞。
?、蹖⒃嚬芸谕ㄟ^火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。
⑤將試管通過火焰,并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙,右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi),劃三至五條平行線,蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán),待其冷卻后,從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復以上操作,在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
·平板劃線操作的討論
1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時,仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么?
答:操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后,接種環(huán)上殘留的菌種,使下一次劃線時,接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端,從而通過劃線次數(shù)的增加,使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少,以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán),能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種,避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。
2.在灼燒接種環(huán)之后,為什么要等其冷卻后再進行劃線?
答:以免接種環(huán)溫度太高,殺死菌種。
3.在作第二次以及其后的劃線操作時,為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線?
答:劃線后,線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少,每次從上一次劃線的末端開始,能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少,最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。
(6)涂布平板操作的步驟:
①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液,滴加到培養(yǎng)基表面。
?、蹖⒄从猩倭烤凭耐坎计髟诨鹧嫔弦?,待酒精燃盡后,冷卻8~10s。
④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。
涂布平板操作的討論
涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求,想一想,第2步應如何進行無菌操作?
提示:應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如,酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。
菌種的保存
(1)對于頻繁使用的菌種,可以采用臨時保藏的方法。
?、倥R時保藏方法
將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上,在合適的溫度下培養(yǎng)。當菌落長成后,將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3~6個月,都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。
②缺點:這種方法保存的時間不長,菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。
(2)對于需要長期保存的菌種,可以采用甘油管藏的方法。
在3mL的甘油瓶中,裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中,與甘油充分混勻后,放在-20℃的冷凍箱中保存。
疑難解答
(1)生物的營養(yǎng)
營養(yǎng)是指生物攝取、利用營養(yǎng)物質(zhì)的過程。營養(yǎng)物質(zhì)是指維持機體生命活動,保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。
人及動物的營養(yǎng)物質(zhì):水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。
植物的營養(yǎng)物質(zhì):礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。
微生物的營養(yǎng)物質(zhì):水、無機鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。
(2)確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法
將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1~2天,無菌落生長,說明培養(yǎng)基的制備是成功的,否則需要重新制備。
課題二 土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)
尿素 是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥,尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后,才能被植物利用。土壤中的細菌之所以能分解尿素,是因為他們能合成脲酶
尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的
篩選菌株
(1)實驗室中微生物的篩選應用的原理
人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等),同時抑制或阻止其他微生物生長。
(2)選擇性培養(yǎng)基
在微生物學中,將允許特定種類的微生物生長,同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基,稱作選擇培養(yǎng)基。
(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)
根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點加入某種物質(zhì)以達到選擇的目的。例如,培養(yǎng)基中不加入有機物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入氮元素,可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。
統(tǒng)計菌落數(shù)目
(1)測定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。
(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理
當樣品的稀釋度足夠高時,培養(yǎng)基表面生長的一個菌落,來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù),就能推測出樣品中大約含有多少活細菌。為了保證結(jié)果準確,一般設(shè)置3~5個平板,選擇菌落數(shù)在30~300的平板進行計數(shù),并取平均值。統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低,因此,統(tǒng)計結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。
采用此方法的注意事項:1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進行計數(shù)
2.為了防止菌落蔓延,影響計數(shù),可在培養(yǎng)基中加入TTC(在計數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細菌菌落長成紅顏色,對去除食品本底顆粒物干擾非常有意義).
3.本法僅限于形成菌落的微生物
設(shè)置對照
設(shè)置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結(jié)果的影響,提高實驗結(jié)果的可信度。對照實驗是指除了被測試的條件以外,其他條件都相同的實驗,其作用是比照試驗組,排除任何其他可能原因的干擾,證明確實是所測試的條件引起相應的結(jié)果。
實驗設(shè)計
實驗設(shè)計包括實驗方案,所需儀器、材料、用具和藥品,具體的實施步驟以及時間安排等的綜合考慮和安排。
(1)土壤取樣:同其他生物環(huán)境相比,土壤中的微生物,數(shù)量最大,種類最多。在富含有機質(zhì)的土壤表層,有更多的微生物生長。從富含有機物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土,在距地表約3~8cm的土壤層取樣。
(2)樣品的稀釋:樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長的菌落數(shù)目。在實際操作中,通常選用一定稀釋范圍的樣品液進行培養(yǎng),以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計數(shù)的平板。
測定土壤中細菌的數(shù)量,一般選用104 105 106
測定放線菌的數(shù)量,一般選用103 104 105
測定真菌的數(shù)量,一般選用102 103 104
(3)微生物的培養(yǎng)與觀察
不同種類的微生物,往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。細菌30~37℃ 1~2天
放線菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天
每隔24小時統(tǒng)計一次菌落數(shù)目,選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果,這樣可以防止因培養(yǎng)時間不足而導致一樓菌落的數(shù)目。一般來說,在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間),同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色
疑難解答
(1)如何從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)?
統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù),最好能統(tǒng)計3個平板,計算出平板菌落數(shù)的平均值
每克樣品中的菌落數(shù)=(C/V)*M 其中,C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù),V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml),M代表稀釋倍數(shù)
課題三 分解纖維素的微生物的分離
纖維素,一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物,是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。
纖維素與纖維素酶
(1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物,木材、作物秸稈等也富含纖維素。
(2)纖維素酶是一種復合酶,一般認為它至少包括三種組分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖,第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖,為微生物的生長提供營養(yǎng)。
纖維素分解菌的篩選
(1)篩選方法:剛果紅染色法。能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。
(2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理
剛果紅是一種染料,它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復合物,但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應。當我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時,剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復合物。當纖維素被纖維素酶分解后,剛果紅-纖維素的復合物就無法形成,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣,我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。
分離分解纖維素的微生物的實驗流程
土壤取樣→選擇培養(yǎng)(此步是否需要,應根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落
(1)土壤采集 選擇富含纖維素的環(huán)境。
(2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板
(3)剛果紅染色法種類
一種是先培養(yǎng)微生物,再加入剛果紅進行顏色反應,另一種是在倒平板時就加入剛果紅。
課題延伸
對分解纖維素的微生物進行了初步的篩選后,只是分離純化的第一步,為確定得到的是纖維素分解菌,還需要進行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實驗,纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測定方法,一般是對纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進行定量的測定。
疑難解答
(1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌?
由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系,在富含纖維素的環(huán)境中,纖維素分解菌的含量相對提高,因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。
(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用?你認為濾紙應該埋進土壤多深?
將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對聚集,實際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。
(3)兩種剛果紅染色法的比較
方法一是傳統(tǒng)的方法,缺點是操作繁瑣,加入剛果紅溶液會使菌落之間發(fā)生混雜;其優(yōu)點是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點是操作簡便,不存在菌落混雜問題,缺點是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì),可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊,因為培養(yǎng)基中纖維素占主要地位,因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點是:有些微生物具有降解色素的能力,它們在長時間培養(yǎng)過程中會降解剛果紅形成明顯的透明圈,與纖維素分解菌不易區(qū)分。
(4)為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物?
在選擇培養(yǎng)的條件下,可以使那些能夠適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖,而那些不適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到“濃縮”的作用。