毛細(xì)管電泳及其在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
毛細(xì)管電泳及其在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用
電泳法(CapillaryElectrophoresis，CE)，是2O世紀(jì)8O年代問世的一種高效液相分離法，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。目前，它已成為能與20世紀(jì)50年代末、6O年代初出現(xiàn)的氣相色譜(GC)以及20世紀(jì)70年代初出現(xiàn)的液相色譜(HPLC)相媲美的一種分離技術(shù)，并被認(rèn)為是當(dāng)代分析科學(xué)最具活力的前沿研究課題。毛細(xì)管電泳法因其分離效率高、分析速度快、樣品用量少、抗污染能力強(qiáng)及易自動(dòng)化等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、高分子等領(lǐng)域，尤其在生物分析及生命科學(xué)領(lǐng)域中已展示了誘人的應(yīng)用前景口。
1毛細(xì)管電泳原理及其特點(diǎn)
毛細(xì)管電泳泛指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)D]。毛細(xì)管電泳儀的基本結(jié)構(gòu)包括一個(gè)高壓電源，一根毛細(xì)管，一個(gè)檢測(cè)器及兩個(gè)供毛細(xì)管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。
毛細(xì)管電泳儀的工作原理：毛細(xì)管電泳所用的石英毛細(xì)管柱，在pHi3情況下，其內(nèi)表面帶負(fù)電，和溶液接觸時(shí)形成一雙電層。在高電壓作用下，雙電層中的水合陽(yáng)離子引起流體整體朝負(fù)極方向移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲。粒子在毛細(xì)管內(nèi)電解質(zhì)中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和。正離子的運(yùn)動(dòng)方向和電滲流一致，故最先流出;中性粒子的電泳速度為“零”，故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度;負(fù)離子的運(yùn)動(dòng)方向與電滲流方向相反，但因電滲流速度一般都大于電泳流速度，故它將在中性粒子之后流出，從而因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離L4]。
與經(jīng)典電泳相比，毛細(xì)管電泳法克服了由于焦耳熱引起的譜帶寬，柱效較低的缺點(diǎn)，確保引入高的電場(chǎng)強(qiáng)度，改善分離質(zhì)量Is]，具有分離效率高、速度快和靈敏度高等特點(diǎn)，而且所需樣品少、成本低，更為重要的是，它又是一種自動(dòng)化的儀器分析方法[a3。毛細(xì)管電泳法與高效液相色譜一樣同是液相分離技術(shù)，很大程度上兩者互為補(bǔ)充，但無論從效率、速度、用量和成本來說，毛細(xì)管電泳法都顯示了它的優(yōu)勢(shì)。如毛細(xì)管電泳法成本相對(duì)較低，且可通過改變操作模式和緩沖液成分，根據(jù)不同的分子性質(zhì)(如大小、電荷數(shù)、手征性、疏水性等)對(duì)極廣泛的物質(zhì)進(jìn)行有效分離，而高效液相色譜法要用價(jià)格昂貴的柱子和溶劑.可見，毛細(xì)管電泳法具有儀器簡(jiǎn)單、分離模式多樣化、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、分離效率高、靈敏度高、分析成本低、環(huán)境污染小等特點(diǎn)。
2.毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法及其影響因素
傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法主要有光學(xué)檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、質(zhì)譜檢測(cè)等。光學(xué)檢測(cè)又可分為紫外吸收檢測(cè)(UVabsorptiondetection)、熱光學(xué)檢測(cè)(Thermoop-ticaldetection)、熒光檢測(cè)(F1uorescencedetection)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(Chemiluminescencedetection)等;電化學(xué)檢測(cè)可分為電位分析檢測(cè)(Potentiometricdetection)、電導(dǎo)率檢測(cè)(Conductivitydetection)、電勢(shì)梯度檢測(cè)(Potentialgradientdetection)、安培分析檢測(cè)(Amper-ometricdetection)等。隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸出現(xiàn)了非水毛細(xì)管電泳(Nonqueouscapillaryelectrophoresis，NACE)、毛細(xì)管陣列電泳(Capillaryarrayelectrophoresis，CAE)，毛細(xì)管電泳免疫分析(Capillary electrophoresisbased immunoassay，CE—IA)、毛細(xì)管電色譜(Capillaryelectrochromatography，CEC)等分支。非水毛細(xì)管電泳法是在以非水為溶劑的緩沖溶液中進(jìn)行的，主要用于分析不易溶于水而易溶于有機(jī)溶劑的物質(zhì)，分離在水溶劑毛細(xì)管電泳中淌度十分相似的物質(zhì)。毛細(xì)管陣列電泳是在常規(guī)毛細(xì)管電泳法原理和技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合微型制造技術(shù)設(shè)計(jì)出來的一種檢測(cè)技術(shù)，是_種新型的生物芯片。毛細(xì)管電泳免疫分析技術(shù)利用抗原抗體復(fù)合物與游離的抗原、抗體在電泳行為上的差異，將毛細(xì)管電泳作為分離與檢測(cè)手段。毛細(xì)管電色譜是一種在毛細(xì)管內(nèi)充填、涂布或鍵合色譜固定相，用電滲流作為驅(qū)動(dòng)力的分離模式嘲。
影響毛細(xì)管電泳法分離的因素主要有以下幾個(gè)方面：①毛細(xì)管。毛細(xì)管是關(guān)鍵部件，管徑、管長(zhǎng)、不同物質(zhì)的涂層厚度對(duì)分辨率均有影響。②電泳緩沖液。電滲分離現(xiàn)象在毛細(xì)管電泳中起著非常重要的作用，而緩沖液的pH值及濃度對(duì)電滲的影響很大，并對(duì)分離度產(chǎn)生效應(yīng)。③電壓。在進(jìn)行電泳時(shí)，進(jìn)樣電壓和操作電壓對(duì)分辨率及操作時(shí)間會(huì)產(chǎn)生影響。④電泳溫度。
電流通過毛細(xì)管會(huì)產(chǎn)生熱量，升高溫度，使物理參數(shù)發(fā)生改變，造成樣品遷移時(shí)間、峰面積的偏差和分離效率下降。
3.毛細(xì)管電泳在種子科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景
3.1在品種鑒定和物種分類上的應(yīng)用
毛細(xì)管電泳與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，具有分析速度快，分辨能力高，分析過程全自動(dòng)化及樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。自1988年發(fā)表第一批關(guān)于毛細(xì)管電泳用于DNA分析的文獻(xiàn)后，即引起眾多科學(xué)家的關(guān)注。目前，毛細(xì)管電泳已被用于DNA純度檢測(cè)，PCR產(chǎn)物分析，DNA序列分析以及酶和多糖蛋白的結(jié)構(gòu)、純度、穩(wěn)定性等方面的研究[7叫。如能將毛細(xì)管電泳運(yùn)用于種子生物技術(shù)領(lǐng)域的研究，對(duì)拓寬種子中酶蛋白、特異基因片段的分離手段和加快物種的鑒定分類有重要意義。
3.2在種子離子分析方面的應(yīng)用
毛細(xì)管電泳在食品分析中應(yīng)用最廣泛和成熟的領(lǐng)域即毛細(xì)管離子電泳(CIE)。目前，毛細(xì)管離子電泳已被用來測(cè)定多種食品基質(zhì)中的無機(jī)離子，如K、Ca抖、Na、NH、SO、F一、Br一等。種子中的離子分析多采用原子吸收光譜法，該儀器不利于普及，應(yīng)用毛細(xì)管電泳的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將大大簡(jiǎn)化已有的檢測(cè)方法，使種子微量元素的測(cè)定更方便、更經(jīng)濟(jì)n。
3.3在種子農(nóng)藥殘留分析方面的應(yīng)用
農(nóng)藥包括殺蟲劑和除草劑兩大類。過去農(nóng)藥殘留量常用高效液相色譜的方法測(cè)定，但隨著毛細(xì)管電泳的發(fā)展，它越來越多地被用于農(nóng)藥殘留分析。目前毛細(xì)管電泳已被用于飲用水、牛奶、啤酒、谷物、馬鈴薯和豬肉等食品中農(nóng)藥殘留的測(cè)定。加入WTO后，為了消除貿(mào)易壁壘，我國(guó)執(zhí)行了更為嚴(yán)格的農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)，這就要求我們?cè)诜N子種植、加工等一系列環(huán)節(jié)加強(qiáng)對(duì)農(nóng)殘含量的監(jiān)控，在這方面國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。毛細(xì)管電泳因其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，將會(huì)在種子農(nóng)殘檢驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。
3.4在研究種子遺傳分析中的應(yīng)用
毛細(xì)管電泳在種子遺傳分析中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，如Gerber等采用高效毛細(xì)管電泳對(duì)大豆種子品質(zhì)的遺傳學(xué)進(jìn)行研究分析引。變異是群體進(jìn)化的基礎(chǔ)，品種內(nèi)變異的兩個(gè)常用度量指標(biāo)是雜合度和多態(tài)信息含量。由于微衛(wèi)星標(biāo)記呈共顯性遺傳，基因型直接反映表型，因此，等位基因頻率可通過簡(jiǎn)單計(jì)算獲得，進(jìn)而得出雜合度和多態(tài)信息含量。應(yīng)用毛細(xì)管電泳快速靈敏地對(duì)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)分析，將極大地推動(dòng)這方面的研究，這些成果將為開展品種保存、選育及開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)]。
3.5在種子營(yíng)養(yǎng)成分分析方面的應(yīng)用
對(duì)種子蛋白的分離與表征，傳統(tǒng)方法多是采用不同模式的聚丙烯酰胺凝膠電泳和高效液相色譜，這些方法在實(shí)際操作中都存在不同程度的局限性，如聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作復(fù)雜，無法進(jìn)行定量分析，且分辨率不高，還要使用有毒試劑等;高效液相色譜雖然在一定程度上克服了聚丙烯酰胺凝膠電泳的不足，但其運(yùn)行成本高，難以在實(shí)踐中廣泛應(yīng)用。毛細(xì)管電泳是從傳統(tǒng)電泳發(fā)展而來的一種高效、新型的分離分析技術(shù)，在蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸等生物分子的分離分析方面顯示出極大的優(yōu)越性。目前這一技術(shù)在作物種子蛋白研究中已取得重要進(jìn)展，并顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
高效毛細(xì)管電泳在煙草糖類化合物分析中的應(yīng)用國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道，如劉少民等采用高效毛細(xì)管電泳一安培法分離測(cè)定了煙草中4種寡糖。馬強(qiáng)等分離測(cè)定了煙草中的5種還原糖(葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖和麥芽糖)Ll。毛細(xì)管電泳還可用于種子內(nèi)氨基酸、有機(jī)酸等組分的測(cè)定，這在食品等領(lǐng)域已有較多報(bào)道[1，可借鑒到種子分析領(lǐng)域，發(fā)展種子營(yíng)養(yǎng)成分分析方法。
作為一種高效分離技術(shù)，毛細(xì)管電泳在食品、藥物、環(huán)境、生物堿、毒品、天然產(chǎn)物等方面的應(yīng)用已顯示出巨大的潛力。目前，毛細(xì)管電泳在種子分析領(lǐng)域的應(yīng)用才剛剛起步，國(guó)內(nèi)已有種子部門開展此方面的應(yīng)用研究，隨著毛細(xì)管電泳技術(shù)研究的深入、毛細(xì)管電泳儀器的普及和種子分析檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展。可以預(yù)計(jì)，毛細(xì)管電泳將在種子領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。