免疫學技術論文(2)
免疫學技術論文
免疫學技術論文篇二
EV71免疫學研究進展
【中圖分類號】R19 【文獻標識碼】B 【文章編號】1004-7484(2013)04-0081-02
腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的單正鏈無包膜RNA病毒。1974年Schmidt等人首次從美國加利福尼亞州患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病的嬰兒患者中分離到EV71病毒，隨后世界上許多國家相繼報道了EV71在不同地區(qū)的流行情況，EV71一共引起了10多次的世界范圍的爆發(fā)和流行，其中又有四次大的流行[2]。我國從2008年阜陽爆發(fā)EV71以來，共報告手足口病例192344例，發(fā)病率為 37.01/10萬，其中重癥病例2119，死亡病例94，在我國主要流行株已經(jīng)從90年代初的B亞型和C2亞型轉(zhuǎn)變?yōu)镃4亞型。 在丙類傳染病中發(fā)病數(shù)位于第三，而死亡數(shù)為第一位。EV71可經(jīng)消化道、呼吸道傳播，易造成流行。EV7l傳染性強，傳播途徑復雜，短時間內(nèi)可造成大規(guī)模流行。人對EV71普遍易感，成人多已通過隱性感染獲得免疫力，因此感染后發(fā)病患者主要為學齡前兒童。EV71感染引起的臨床表現(xiàn)多樣，主要表現(xiàn)為手足口病(hand footmouth disease，HFMD)，部分患兒表現(xiàn)為皰疹性咽峽炎，少部分重癥患者出現(xiàn)腦炎、腦脊髓膜炎、肺水腫、肺出血等。
目前尚無有效疫苗能預防感染，臨床主要以對癥治療為主，缺乏特異、高效的抗病毒藥物，尤其是EV71感染所致重癥病例病情進展快，預后差，病死率高，對于EV71的基礎研究目前也只停留在比較基礎的水平。研究EV71作為一種病原所引發(fā)的機體免疫應答，對了解病毒的致病機制、制定預防診治策略具有重要意義。
一、病毒結(jié)構
EV71的病毒顆粒呈二十面體立體對稱近似球形的結(jié)構，直徑24～30 nm，無包膜。核衣殼由60個亞單位構成，每個亞單位由四種衣殼蛋白(VPl、VP2、VP3、VP4)組成的五聚體構成。病毒基因組為7408個核苷酸，僅有一個開放閱讀框(ORF)，編碼含2193個氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，多聚蛋白進一步水解為 VP1，VP2，VP3和VP4，這四個外殼蛋白先形成原聚體，再由5個原聚體結(jié)合形成病毒顆粒。在其兩側(cè)分別為5’～非編碼區(qū)和3’一非編碼區(qū)。3’一非編碼區(qū)的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)，而其5’末端共價結(jié)合有一個小分子量的蛋白(VPg)。在這四種結(jié)構蛋白中，VP4位于衣殼內(nèi)部，與病毒核心連接，VPl、VP2和VP3均暴露在病毒衣殼表面，帶有抗原表位。VPl還與病毒與靶細胞的結(jié)合有關。
二、病毒受體的研究
腸道病毒在人體內(nèi)具有廣泛的受體，病毒感染人體后可與不同靶組織的受體相結(jié)合，從而出現(xiàn)復雜的臨床表現(xiàn)。病毒與宿主細胞受體的特異性結(jié)合決定了病毒感染的組織趨向性，不同種類和型別的腸道病毒，其特異性受體不完全相同。腸道病毒的特異性受體至少包括細胞間黏附分子 -1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、晚期活化抗原-2(very late activation antigen，VLA-2)、補體衰變加速因子(decay accelerating factor，DAF)等。VP1蛋白在病毒表面形成的峽谷樣結(jié)構是受體的結(jié)合位點。感染細胞時，病毒首先與細胞表面的特異性受體結(jié)合，完成吸附過程，然后病毒空間構型發(fā)生改變，丟失VP4并最終脫去衣殼，病毒RNA進入胞漿。病毒RNA為感染性核酸，進入細胞后可直接起mRNA作用，轉(zhuǎn)譯出多聚蛋白，多聚蛋白經(jīng)酶切后形成病毒結(jié)構蛋白和功能蛋白。細胞被感染后約30分鐘，細胞蛋白合成迅速下降至零，稱為“關閉”(shut-off)，主要由腸道病毒蛋白酶裂解細胞真核翻譯起始因子-4G(eukaryote initiation factor 4G，eIF-4G)造成。細胞蛋白翻譯“關閉”是腸道病毒細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)的主要機制。Betsy Yang[7]等在2009年曾報道在DLD-1人結(jié)腸腺癌細胞表面的吐液酸化的葡聚糖是EV71病毒的后來，后來日本的兩位科學家Seiya Yamayoshi和Yorihiro Nishimura等經(jīng)過一系列實驗分別證明了清道夫受體B2和P選擇素糖蛋白配體1均是EV71病毒在人細胞上的受體分子。
三、體液免疫應答
特異性體液免疫產(chǎn)生的中和性抗體在病毒感染的預防以及疾病后期降低病毒載量方面都有很明顯的意義，對EV71引起的體液免疫的研究由來已久，其他體液免疫的研究主要為疾病診斷提供了輔助手段。Foo等在EV71的VPl上發(fā)現(xiàn)一個線性表位SP32，蛋白印記實驗顯示重組表達的谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)一SP32融合蛋白能與人EV71 IgG抗體特異性結(jié)合，而與柯薩奇病毒CA9和埃可病毒(Echo 6)無反應。Wang等[13]設計一種檢測抗EV71 IgM的ELISA實驗，用于EV71感染的早期診斷。用該方法檢測236例患者的336份標本，以病毒分離和中和實驗為標準，該ELISA法的敏感性和特異性分別達到97.7%和93.3%，發(fā)病7 d以內(nèi)IgM即可呈陽性，并可持續(xù)到發(fā)病后94 d。這一方法有望為I臨床早期診斷EV71感染提供輔助手段。Jian-Feng Han等報道非中和性抗體能在體內(nèi)外實驗中可以加重EV71感染后的癥狀，在THP-1細胞和乳鼠模型中均能增加細胞的病變和動物的感染癥狀。Shih-Min Wang]等發(fā)現(xiàn)，在針對EV71非中和性抗體存在的條件下，病毒對THP-1細胞的質(zhì)細胞病變作用更加強烈。而這一增強作用可以被抗-Fcγ抗體減弱，這個Fcγ主要存在于6-11個月的嬰兒體內(nèi)，這就解釋了為什么嬰幼兒感染感染EV71病毒以后的癥狀要比成人嚴重。
四、細胞免疫應答
機體對病毒抗原的細胞免疫應答主要依賴于兩種細胞，即由主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ限制的CD4+T細胞和受MHCⅠ分子限制的CD8+T細胞。CD4+T細胞主要分泌細胞因子如白細胞介素IL-2、IL-3、IFN-γ和TNF-β等來調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫應答，CD4+的Th細胞與CD8+T細胞接觸以輔助CD8+T細胞分化成CTL細胞用以特異性殺傷靶細胞，產(chǎn)生細胞毒作用。既往有對不同腸道病毒結(jié)構蛋白保守序列的免疫原性進行研究。Cello]等合成15個存在于六種不同腸道病毒結(jié)構蛋白上的保守區(qū)域肽段，有9個肽段能刺激健康獻血員的外周血單個核細胞產(chǎn)生的IFN-γ，而且其中4個肽段能誘導T細胞增殖。這一研究表明，在脊髓灰質(zhì)炎病毒1，柯薩奇病毒B3、B5、B6、A9和埃可病毒間存在保守的T細胞表位，這些表位多位于VP2和VP3核殼蛋白上，VP1上較少，而VP4上未發(fā)現(xiàn)交叉反應性的T細胞表位。提示包括EV71在內(nèi)的腸道病毒結(jié)構蛋白保守序列可能存在的表位，值得深入研究。Chang]等對EV71感染后不同疾病轉(zhuǎn)歸患者的細胞和體液免疫應答的研究發(fā)現(xiàn)，同時出現(xiàn)腦干腦炎及肺水腫患者的細胞免疫應答顯著低于僅有中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累患者和輕癥患者，具體表現(xiàn)在肺水腫患者的PBMC經(jīng)EV71抗原刺激后，IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-a、巨噬細胞炎癥蛋白-lα(M1P-lα)等的產(chǎn)生明顯低于其他患者，而不同患者組間中和抗體效價差異無統(tǒng)計學意義。推測EV71感染后肺水腫的出現(xiàn)可能與特異性細胞免疫應答強度較弱有關。Yang等探討EV71感染后出現(xiàn)腦膜腦炎與未出現(xiàn)腦膜腦炎患兒免疫應答的差異，發(fā)現(xiàn)CD4+細胞表面CD40配體的表達在腦膜腦炎組顯著下降，檢測該組患兒細胞毒性T淋巴細胞抗原-4基因多態(tài)性，顯示其外顯子1的49位上G/G基因型頻率顯著高于無腦膜腦炎組，而中和抗體效價無論在急性期還是康復期，兩組間差異均無統(tǒng)計學意義。提示細胞免疫的異?？赡芘cEV71感染的中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累有關。 總之，EV71感染后機體能產(chǎn)生保護性免疫應答，其中中和抗體在清除病毒、預防感染中發(fā)揮重要作用，非中和性抗體的存在可以加速疾病的癥狀。而細胞免疫應答可能與感染后病情輕重及不同臨床轉(zhuǎn)歸有 關。
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