rna干擾技術論文怎么寫(2)
rna干擾技術論文篇二
RNA干擾技術在消化系腫瘤基因治療中的應用
【關鍵詞】 RNA干擾 小干涉RNA 消化系腫瘤 基因治療
RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)所誘發(fā)，高度特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，使基因沉默的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象發(fā)生在轉錄后水平，故又稱為轉錄后基因沉默(post?transcriptional gene silencing，PTGS)[1]。RNAi是生物體在進化過程中抵御病毒入侵，抑制由轉座子移動或重復序列的積累引起的基因組不穩(wěn)定的保護機制，另外還是基因表達調(diào)控的一條重要途徑。小干涉RNA(small inter?fering RNA，siRNA)是指干涉RNAi過程中在細胞內(nèi)產(chǎn)生的長約21～23核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi發(fā)揮功能的重要中間效能分子。RNAi自從1998年發(fā)現(xiàn)以來，就以其獨特的優(yōu)勢在功能基因組學研究中迅速占有一席之地，迄今已成為基因研究中不可或缺的工具之一，并且隨著對其作用機制的逐步了解和應用技術的日漸成熟，已開始應用于疾病防治等多個方面。本文就其機制，主要特征，以及在消化系腫瘤中的研究作一簡單綜述。
1 作用機制及主要特征
1.1 作用機制
RNAi在哺乳動物細胞中有兩種作用機制：一種是大于30 nt的長雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生的廣泛的、非特異性效應。其機制可能是激活了細胞內(nèi)的蛋白激酶R和RNA酶L，從而導致了非特異性的細胞凋亡。另一種是21～23 nt的短雙鏈RNA(siRNA)產(chǎn)生的相對具體的、特異性效應。目前，RNAi在抗病毒及腫瘤中的研究主要集中在siRNA產(chǎn)生的特異性效應，故下面主要介紹siRNA的作用機制。
siRNA的作用機制目前尚未完全闡明，但已基本達成共識，即①dsRNA在細胞內(nèi)與DICER酶(一種RNAaseIII家族中特異性識別dsRNA的酶)結合，隨即被分割成21～23個核苷酸的短鏈dsRNA，在這個過程中需要ATP的參與。②分割下來的短鏈dsRNA即為siRNA，它是RNAi的起始誘導物，與DICER酶形成RNA引導的沉默復合體(RISC)，此時RISC無活性，隨后，siRNA經(jīng)歷一個依賴ATP的解雙鏈過程激活RISC[2]。③siRNA特異性地識別靶基因轉錄的mRNA，并引導RISC結合mRNA，RISC中的DICER酶將mRNA切割成21～23個核苷酸片段，此后mRNA被逐步降解，導致不能進行翻譯過程，從而引起目的基因沉默，抑制靶基因的表達。④新產(chǎn)生的dsRNA(siRNA)可繼續(xù)形成RISC復合物進入新一輪RNAi的循環(huán)，產(chǎn)生正反饋效應。這一過程需在RNA依賴RNA聚合酶(RdRP)的條件下進行。除上述機制外，轉基因真核生物dsRNA 還可引起相應基因的甲基化，促使異常RNA產(chǎn)生，最終導致基因沉默[3,4]。
1.2 主要特征
1.2.1 高度特異性 RNAi嚴格遵循堿基配對原則，只降解與之同源的基因的RNA，達到阻止基因表達的目的。
1.2.2 高效性 相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應基因的表達，在哺乳動物中雖沒發(fā)現(xiàn)擴增效應，但在細胞實驗中只需摩爾級濃度的 siRNA 即可有效抑制目標基因的表達。
1.2.3 可傳遞性和可遺傳性 RNAi抑制基因表達的效應可跨越細胞的界限，甚至可以傳播至整個有機體及子代細胞。
1.2.4 濃度、時間雙重依賴性 在一定時間內(nèi)RNAi的效應強度隨siRNA的濃度增高而增強，或濃度一定的情況下，隨著時間延長，siRNA在細胞內(nèi)發(fā)生正反饋效應，導致濃度增高，使RNAi效應增強。
1.2.5 ATP依賴性 目前研究發(fā)現(xiàn)RNAi中至少有2個步驟消耗ATP[5]：DICER酶切割dsRNA成為siRNA并使其5′端磷酸化或胞內(nèi)磷酸化酶使導入的siRNA 5′端磷酸化而使其成為有活性的siRNA的過程;RISC活化即siRNA解雙鏈的過程。
2 RNAi在消化系腫瘤治療中的應用
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與原癌基因的激活，抑癌基因的失活，以及凋亡相關基因的異常表達等均有密切的關系。因此我們可以針對這些因素，利用RNAi相關技術在不影響正?；蚬δ艿臈l件下抑制突變基因表達或基因的表達過量，從而達到基因治療的目的。另外，腫瘤是多個基因相互作用的基因網(wǎng)絡調(diào)控的結果，當單一癌基因的阻斷不能完全抑制或逆轉時，可以設計一種針對同一家族多個基因的保守序列的siRNA分子，便可以同時抑制這一家族的多個基因表達，且抑制效果互不干擾。
2.1 原癌基因
原癌基因是細胞基因組內(nèi)正常的組成成分，自然狀態(tài)下無致癌作用，其主要作用是通過編碼生長因子等調(diào)節(jié)正常細胞的生長、分化。原癌基因激活是腫瘤發(fā)生的根本原因之一，因此，如何抑制原癌基因的激活成為目前研究腫瘤治療的熱點之一。
2.1.1 Ras基因 Ras基因是目前已知的在人類腫瘤中呈活化狀態(tài)最普遍的原癌基因，有數(shù)據(jù)顯示此基因的突變現(xiàn)象存在于30%～50%的腫瘤組織中，在胰腺癌中可高達85%。Brummelkamp等[6]建立了突變體的表達系統(tǒng)即pSUPER?K?rasv12，轉染人胰腺癌CAPAN?1細胞系后，觀察到pSUPER?K?rasv12能顯著降低K?rasv12的mRNA表達水平。構建突變體K?rasv12的siRNA病毒載體轉染CAPAN?1細胞亦能抑制細胞克隆生長，并阻止裸鼠腫瘤的形成;而對照組細胞生長良好并產(chǎn)生克隆，體內(nèi)裸鼠實驗5周內(nèi)均長出腫瘤，因此證明了該siRNA具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長的作用。 同時，他們采用反轉錄病毒載體RNA系統(tǒng)在體外也成功地抑制了ras基因的表達。
2.1.2 Fos基因 Fos基因是一個重要的促進腫瘤細胞轉移的基因，其產(chǎn)物Fos蛋白與腫瘤細胞的運動有關。Fra?1蛋白是Fos蛋白家族的成員之一，主要在大腸癌Hct?116細胞株和BE細胞株中表達。用siRNA 轉染fosL基因，然后再轉染到BE細胞中，發(fā)現(xiàn)Fra?1蛋白對細胞的增殖沒什么影響，卻極大地降低了BE細胞的運動能力，大約降低為原來的1/10[7]。
2.2 抑癌基因
由于抑癌基因在細胞增殖調(diào)控中起重要作用，因此也成為基因治療的重要目標之一。p53基因是最早利用RNAi技術研究的基因之一，人體內(nèi)大約50%腫瘤的發(fā)生是p53基因突變的結果。p53基因能夠抑制DNA合成及誘導DNA修復來抑制細胞生長，使細胞停滯在G1期。突變型p53失去對細胞增殖的負調(diào)控作用，導致細胞增殖失控發(fā)生癌變。Martinez等[8]的報道中，將H1299細胞轉染野生型p53和突變型p53的RNA表達型質(zhì)粒，結果，野生型siRNA明顯抑制野生型p53蛋白的表達，對突變型幾乎無效;而突變型siRNA顯著抑制突變型p53蛋白表達，野生型基因則不受影響。由此證明，RNA序列能特異性地分別抑制這兩個基因的表達，并且對突變型p53的抑制可在一定程度上恢復野生型基因的表達和功能。這就為選擇性和個體化治療腫瘤提供了可能。
2.3 細胞凋亡相關基因
細胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡對于機體的生長發(fā)育有著舉足輕重的影響。凋亡過程的失調(diào)可能導致腫瘤的發(fā)生。有研究表明[9]，將表達有綠色熒光蛋白(GFP)的Bcl?XLsiRNA轉染人胃癌細胞株MGC?803，用RT?PCR和免疫熒光法檢測Bcl?XL的表達，48 h后發(fā)現(xiàn)，與siRNA陰性組相比，實驗組GFP明顯減少，Bcl?XL蛋白和Bcl?XL mRNA表達減少到基準水平以下，并有自發(fā)的細胞凋亡現(xiàn)象，凋亡率達21.17%。這就說明Bcl?XL特異性siRNA能夠抑制凋亡抑制基因Bcl?XL的表達，從而誘導胃癌細胞株MGC?803凋亡。
2.4 其他相關基因
2.4.1 Her2基因 Her2基因在胃癌等腫瘤的發(fā)病中起到重要作用，尤其見于彌散型胃癌。有研究表明將核仁蛋白NoL8特異性siRNA轉染3種彌漫型胃癌細胞ST?4，MKN45，TMK?1，可以有效地降低該基因的表達，并能誘導這些細胞發(fā)生凋亡。因此，可以考慮把Her2作為胃癌基因治療的又一新的靶點[10]。
2.4.2 β?連環(huán)蛋白和APC基因 β?連環(huán)蛋白和APC基因是WNT信號傳導途徑的關鍵成分。這些基因的突變可引起β?連環(huán)蛋白表達水平增加，導致細胞過度增生，促進結腸息肉和結腸癌的發(fā)生。Verma等[11]構建了β?連環(huán)蛋白的多個靶區(qū)域，使得蛋白表達量降低90%。有學者進一步用轉染β?連環(huán)蛋白siRNA 的結腸癌HCT116細胞注射裸鼠，發(fā)現(xiàn)有50%的老鼠存活超過70 d，而對照組則全部死亡。
2.4.3 血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF) VEGF是體內(nèi)一種重要的促血管生成因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后過程中均有著極其重要的作用。Zhang等[12]設計了針對鼠VEGF各亞型的siRNA，以DNA為模板在細胞內(nèi)誘導小片段雙鏈RNA的形成，干擾結果均特異性抑制相應VEGF的表達。同時，Takei等[13]設計了針對人VEGF的siRNA，采用體外合成法得到相應的siRNA，將其注入到荷瘤鼠模型的腫塊中。結果腫瘤組織中的VEGF在mRNA水平和蛋白水平的含量明顯低于對照組，腫瘤體積亦明顯小于對照組。徐文華等[14]設計兩組針對VEGF?mRNA 的siRNA,用脂質(zhì)體轉染人胃腺癌細胞系SGC?7901,觀察其細胞周期的變化。發(fā)現(xiàn)G0/G1期細胞增多, S期細胞減少,細胞周期阻滯于G0/G1期;并能誘導細胞凋亡產(chǎn)生凋亡小體。這些結果無疑將給腫瘤的基因治療提供了新的思考方向。
2.4.4 TGF?β1 TGF?β1是一種多功能生長調(diào)節(jié)因子，與多種腫瘤的轉移關系密切。它可使胃癌細胞表達的黏附分子如CD44表達增多;抑制腹腔內(nèi)淋巴細胞活性使其無法有效殺傷腹腔內(nèi)游離癌細胞以及血管生成，同時可使間皮細胞變形，腹膜纖維化等。吳濤等[15]利用載體介導的RNAi技術干擾TGF?β1，發(fā)現(xiàn)TGF?β1蛋白在人胃癌細胞株SGC?7901中下降約65.8%，腹膜間皮細胞TGF?β1蛋白下降約61.8%。這一結果有力證明了siRNA能抑制TFB?β1在人胃癌細胞株SGC?7901和腹膜間皮細胞中的表達，為今后胃癌腹膜轉移靶向治療奠定了堅實的基礎。
2.4.5 埃茲蛋白(Ezrin) Ezrin作為ERM (ezrin radixin moesin)蛋白家族的成員,是一種細胞膜與細胞骨架的連接蛋白，其主要功能是參與細胞的生長和信號轉導,接受胞外信號,使骨架蛋白重新排布,并增加細胞運動能力。近來發(fā)現(xiàn), Ezrin的表達與大多數(shù)腫瘤轉移相關,如Ezrin表達水平與黑素瘤的分級[16]和乳腺癌的發(fā)生轉移[17]均呈正相關。顏歌等[18]采用小干擾RNA 方法抑制腸癌細胞系Lovo和SW480中的Ezrin的表達,發(fā)現(xiàn)Ezrin mRNA和蛋白表達水平均顯著下調(diào)，腫瘤細胞的運動侵襲能力下降,穿過人工基底膜的細胞數(shù)量明顯減少。這預示Ezrin蛋白有可能成為抑制腸癌發(fā)展、轉移的新靶點。
2.4.6 多藥耐藥(multidrugresistance，MDR) MDR一直是腫瘤治療的棘手問題之一。研究證實抑癌基因Runx3的缺失和胃癌MDR相關, Guo等[19]應用siRNA敲除Runx3基因后發(fā)現(xiàn)癌細胞對多種化療藥物耐藥,將攜帶Runx3的真核生物表達載體轉染人類胃癌耐藥細胞系SGC7901,體外藥敏性分析顯示SGC?7901 對各種化療藥物敏感。進一步分析顯示Runx3可以抑制MDR?1和MDR相關蛋白1 (MRP?1)啟動子的活性, Runx3的高表達可能通過下調(diào)MDR?1，MRP?1，Bcl?2的表達,進而使胃癌細胞對化療敏感。另外，其中的MDR1基因的過度表達及其基因產(chǎn)物P糖蛋白增加是導致MDR的重要原因之一，Nieth等[20]設計了特異的siRNA分別處理胰腺癌EPG85?257RDB細胞和胃癌EPG85?181RDB細胞來抑制MDR1的表達。結果發(fā)現(xiàn)這兩種細胞的MDR1的mRNA和蛋白表達量可降低90%以上，癌細胞對柔紅霉素的耐藥作用分別降低了89%和58%。這也提示我們，siRNA介導RNAi技術為克服腫瘤耐藥問題可能提供新的策略。
2.4.7 保羅樣激酶1(Polo?like kinase 1, Plk1) Plk1是絲氨酸-蘇氨酸激酶之一，參與了有絲分裂的不同階段。Jang等[21]檢測發(fā)現(xiàn)280例胃癌患者中Plk1表達率高達95%(268/280)，用RNAi的方法阻斷Plk1表達后，癌細胞的生長明顯受抑。用siRNA敲除Plk1基因后，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白B的表達增加，胃癌細胞堆積于G2/M期，有絲分裂紡錘體形態(tài)異常，染色體分離延遲，胞質(zhì)分裂延遲或者停止，增殖減慢[22,23]。另外，Plk1基因的缺失亦伴隨癌細胞凋亡的增加，提示Plk1可能成為胃癌基因治療的理想靶點。
3 問題與展望
RNAi這一方興未艾的新技術，為腫瘤及其他疾病的基因治療提供了新的途徑。但是仍有許多問題亟待解決：①如何在體內(nèi)實現(xiàn)靶基因RNA轉移到所有腫瘤細胞并穩(wěn)定持久地抑制癌基因表達;②如何確定21～23 nt左右的核甘酸序列作為siRNA模板的選擇原則;③如何提高載體系統(tǒng)的效率等等?？傊琑NAi技術作為一種研究的新工具，治療的新手段，隨著對其機制的不斷認識和技術的改進，必將在消化系腫瘤的研究及治療中擔任不可替代的角色，同時也預示著后基因組時代里一個嶄新的RNA時代的到來。
【參考文獻】
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